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細胞分離技術
  • 發布日期:2017-12-19      瀏覽次數:1990
    • 1.  從原代組織中分離細胞 將組織塊分離(散)成細胞懸液的方法有多種,zui常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。

       

      從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短,以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個組織,獲得較高產量的有活性細胞。

       

      (1)胰蛋白酶 (Trypsin)

      ●在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。

      ●將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。

      ●在4℃孵育6到18小時,使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。

      ●移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

      ●在組織碎片加入熱的*培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

      ●通過無菌不銹鋼絲網(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進行培養。

       

      (2)膠原酶 (Collagenase)

      ●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

      ●加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

      ●在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

      ●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

      ●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

      ●再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。

       

      (3)Dispase

      ●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

      ●加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液)

      ●在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

      ●通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

      ●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

      ●再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。

       

      2.  從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞,且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細胞系的廣泛應用,每一種系統*條件和施用濃度應該根據經驗加以確定。

       

      ●再次培養時檢測細胞的活性。

      ●細胞的活率應該超過90%

      ●對于無血清培養基,降低胰蛋白酶使用量。

       

      (1) 移棄使用過的細胞培養基。

      (2)使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗細胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養瓶對著細胞的一面加入清洗溶液,通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。

      (3) 以2~3 ml/25 cm2的量,加選擇的分離液(見表)到培養瓶對著細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶,輕輕搖動培養瓶。通常,在5到15分鐘內,細胞就會脫落。細胞分離需要的時間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過程,避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系,可以輕輕敲打,以加速分離過程。

      (4)當細胞*分離時,垂直放置培養瓶,讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基,通過移液管在單層細胞表面反復吹打來分散細胞。計數并再次培養細胞。

      (5)對于無血清培養基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

    魏經理
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